الصفحة الرئيسية > أخبار > أخبار الشركة

8 شروط للكائنات الحية الدقيقة للتعبير عن البروتين

تحديث الوقت : 2020-09-27

المصدر:

الآراء : 51

8 شروط للكائنات الحية الدقيقة للتعبير عن البروتين

يعد التعبير عن البروتين في الكائنات الحية الدقيقة تقنية أساسية في التكنولوجيا الحيوية. من السهل نسبيًا التعبير عن البروتين في مضيف مشابه لمصدر البروتين المستهدف.

ومع ذلك ، في معظم الأوقات ، نحتاج إلى التعبير عن البروتين في مضيف يختلف عن مصدر البروتين ، مثل التعبير عن البروتينات حقيقية النواة في الخلايا بدائية النواة ، وهو أمر يمثل تحديًا عادةً.


هنا ، تشارك شركةGeneral Biosystems معك العديد من الأدوات التي تساعد على تحقيق تعبير البروتين عبر الأنظمة.

1. كودون الأمثل
يتمثل تحسين Codon في تقديم الكودونات التي يكون النظام المضيف أكثر استعدادًا لقراءتها في المتجه الذي أنشأناه ، بحيث يمكن ترجمته إلى أحماض أمينية بسهولة أكبر ، مما سيزيد من سرعة الترجمة ويزيد من كفاءة تعبير البروتين.

2. علامات التنقية

عندما نعبر عن البروتينات في الكائنات الحية الدقيقة ، فإننا ننتهي عادة بتنقية البروتينات. بالطبع ، إذا كنت تستخدم فقط مستخلصات الخلايا الكاملة أو المستخلصات المتحللة ، فلن تحتاج إلى التفكير في تنقية البروتين.

من أجل تحقيق تنقية البروتين ، يجب أن نضيف علامات تنقية للبروتين. في الوقت الحاضر ، تمت دراسة العديد من علامات التنقية بشكل منهجي وتطبيقها في الممارسة العملية. تشمل علامات التنقية شائعة الاستخدام علامته ، وعلامة Strep-II ، و GST ، و Flat-Tag ، وما إلى ذلك.


3. مرافقين جزيئية وإنزيمات قابلة للطي
من أجل الحصول على بروتين مفيد ، من المهم جدًا التأكد من أن البروتين مطوي بشكل صحيح. من أجل مساعدة البروتين على الانطواء بشكل صحيح ومنع تكوين أجسام متضمنة غير قابلة للذوبان ، نحتاج إلى نواقل مساعدة تعبر عن مرافقين وإنزيمات قابلة للطي.

4. موقع التعبير البروتيني

قبل التجربة ، نحتاج إلى التفكير في مكان التعبير عن البروتين ، سواء تم إفرازه في السيتوبلازم أو المادة بين الخلايا أو خارج الخلية.

إذا كان البروتين يحتوي على روابط ثنائي كبريتيد ، فمن الأفضل أن نعبر عنه في البيئة المؤكسدة للمادة بين الخلايا.

يمكن أن تساعد البيئة المؤكسدة البروتينات في تكوين روابط ثاني كبريتيد الصحيحة للحصول على الهيكل الصحيح.

إذا كنت تريد التعبير عن البروتين في مكان معين في الخلية أو إفرازه خارج الخلية ، فأنت بحاجة إلى إضافة إشارة ببتيد إلى الطرف N للبروتين. بمساعدة ببتيدات الإشارة ، يمكن نقل البروتينات إلى مواقع محددة.


5. مسار التعبير البروتيني

يتميز إفراز البروتين وتعبيره بالعديد من المزايا. من ناحية أخرى ، يمكن أن يؤدي إفراز البروتينات والتعبير عنها إلى تقليل السمية والعبء الأيضي على البكتيريا المضيفة وزيادة قدرة البكتيريا على التكيف ؛ من ناحية أخرى ، فإن محتوى بروتين البكتيريا المضيفة في الفضاء المحيط بالبلازما والوسط خارج الخلية منخفض جدًا ، مما يساعد على تنقية البروتين المستهدف.

مسارات التعبير المختلفة لها تأثير كبير على كفاءة طي البروتينات.


6. إجهاد التعبير

سلالات الإشريكية القولونية المختلفة لها اختلافات كبيرة في ظروف الثقافة وقدرات التعبير الجيني الأجنبي. لذلك ، يلعب اختيار البكتيريا المضيفة المختلفة دورًا حيويًا في تراكم منتجات التعبير والفصل والتنقية النهائية.

يمكن أن يؤدي استخدام سلالات متحولة معيبة في تعبير البروتياز إلى زيادة إفراز البروتينات المؤتلفة والتعبير عنها.

يمكن لبعض السلالات المعيبة (مثل الطفرات الجينية التي تصنع عناصر الغشاء الخارجي) إنتاج بروتينات نشطة قابلة للذوبان ذات بنية مكانية صحيحة وروابط ثاني كبريتيد ، ويمكنها تجنب التأثير المعيق لجدار الخلية في النقل عبر الغشاء للبروتينات الأجنبية وتسهيل إفراز البروتينات المؤتلفة في وسط الثقافة.


7. عوامل مثل وسط المزرعة ودرجة الحرارة وظروف الاستقراء وما إلى ذلك.

سيؤثر التركيب المتوسط وطريقة الاستزراع وظروف الاستزراع وتراكم المستقلبات المثبطة أثناء عملية الاستزراع على تعبير وإفراز البروتين المؤتلف في البكتيريا المهندسة. من بينها ، تعتبر التركيبة الغذائية للوسط ودرجة الحموضة ودرجة الحرارة من العوامل المهمة التي تؤثر على نمو وتعبير البروتينات الغريبة للبكتيريا المهندسة ، ويمكن أن تؤثر على نشاط وإفراز وتعبير البروتياز.

يمكن أن تؤدي إضافة الجلايسين إلى وسط المزرعة إلى تعزيز إفراز البروتين من الفراغ المحيط بالبروتين إلى خارج الخلية دون التسبب في انحلال البكتيريا ، ولا يسبب تحللًا بكتيريًا كبيرًا. يمكن أن تؤدي إضافة صمغ السكر و TritonX-100 إلى الوسط إلى منع تكوين أجسام متضمنة في التجويف المحيطي وتحسين كفاءة التعبير خارج الخلية.

سيؤدي تغيير الضغط الاسموزي لتحريض الصدمة الحرارية على المدى القصير والمتوسط وخفض درجة الحرارة أثناء الحث إلى زيادة التعبير القابل للذوبان عن البروتين المؤتلف في E. coli.

بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للسلالات التي تتطلب تحريض IPTG ، يجب تحسين وقت الاستقراء ودرجة الحرارة ووقت الثقافة.


8. وقت ثقافة الخلية

يعتبر وقت زراعة الخلايا المناسب عاملاً مهمًا يحدد سلامة الخلية ومستوى تعبير البروتين. سيؤدي وقت زراعة الخلايا الطويل إلى تحلل الخلايا وفقدان البروتين المستهدف وإطلاق البروتياز السام.

النتيجة المباشرة لوقت زراعة الخلايا القصير جدًا هو أن تركيز الخلية ليس كافيًا وأن إنتاج البروتين المستهدف منخفض جدًا. لذلك ، يجب تحسين وقت زراعة السلالات المؤتلفة.