الصفحة الرئيسية > أخبار > اخبار الصناعة

مزايا تعبير البروتين الخاص به وتنقيته

تحديث الوقت : 2020-11-06

المصدر:

الآراء : 40

مزايا تعبير البروتين الخاص به وتنقيته
تعتمد علامته على السلسلة الجانبية لبقايا الهيستيدين على سطح البروتين. في ظل الظروف المحايدة والقلوية الضعيفة ، يمكن أن تتفاعل مع أيونات المعادن الثابتة (مثل أيونات النيكل ، أيونات الزنك ، أيونات Co ، إلخ) للحصول على البروتين النقي. إنها واحدة من علامات تنقية البروتين الشائعة في الوقت الحاضر.

1. ما هي علامته?

علامته هي العلامة الأكثر استخدامًا لتعبير البروتين المؤتلف وتنقيته. سواء كان البروتين المعبَّر عنه قابل للذوبان أو جسم متضمن ، يمكن تنقيته بواسطة كروماتوجرافيا تقارب أيون الفلز الثابت (IMAC).

كروماتوغرافيا تقارب المعادن باستخلاب المعادن ، والمعروفة أيضًا باسم كروماتوغرافيا تقارب أيونات المعدن الثابت (IMAC) ، هي نوع جديد من تقنية الفصل تم تطويرها في الثلاثين عامًا الماضية.

تم اقتراحه لأول مرة من قبل Paroth et al. تستخدم هذه الطريقة مبدأ أن بعض الأحماض الأمينية الموجودة على سطح البروتين ، مثل الهيستيدين والتربتوفان والسيستين ، يمكن أن تتفاعل مع أيونات المعادن لفصل البروتين.

تشمل هذه الوظائف الترابط المنسق والامتصاص الكهروستاتيكي والرابط التساهمي من بينها ، تنسيق الترابط هو الرئيسي. من بينها ، علامة 6-هيستيدين (His-Tag) هي الأكثر استخدامًا.


توفر علامة التنقية His-Tag جنبًا إلى جنب مع كروماتوغرافيا تقارب المعدن أداة قوية لفصل البروتينات المؤتلفة والتعبير عنها وتنقيتها.

نظرًا لأن كروماتوغرافيا تقارب المعادن لها خصائص الترابط البسيط ، وسعة الامتصاص الكبيرة ، وظروف الفصل المعتدلة ، والتنوع القوي ، يمكن اختيار ظروف تحميل العينة في نطاق واسع ، في ظل ظروف ارتفاع الملح ، وتركيز معين من المُحول والمنظفات تحت الغطاء ، يمكن دمج البروتينات ذات علامات التنقية 6His بشكل خاص مع مواد مالئة التقارب ، لتصبح تدريجياً واحدة من أكثر التقنيات فعالية لفصل وتنقية البروتينات ومنتجات الهندسة الحيوية الأخرى.


2. علامته هي الخيار الأول لتنقية البروتين


(1) علامة His-Tag صغيرة جدًا وليس لها تأثير على بنية البروتين بعد تبلور بروتين الاندماج ؛

(2) تتوافق علامة His-Tag في الطرف N مع آلية النسخ والترجمة للبكتيريا ، مما يؤدي إلى تعبير البروتين وتنقيته ؛

(3) يعد استخدام IMAC (كروماتوغرافيا تقارب أيون معدني غير متحرك) لتنقية بروتين اندماج His-Tag أسهل ؛

(4) ليس له أي تأثير تقريبًا على خصائص البروتين المستهدف نفسه ، ولن يشكل ثنائيات ؛

(5) إن المناعة في His-Tag منخفضة نسبيًا ، ويمكن حقن البروتين المنقى مباشرة في الحيوانات للتحصين وإعداد الجسم المضاد ؛

(6) أنشئ علامة تقارب مزدوجة مع علامات تقارب أخرى ، ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من أنظمة التعبير.

3. المشاكل الشائعة لتنقية بروتين علامة له


(1) لا يرتبط بروتين علامته بالوسيط

  • السبب المحتمل: قوة الموجات فوق الصوتية غير المناسبة (كبيرة جدًا ، البروتين مكربن ، صغير جدًا ، لا يتم إطلاق البروتين بالكامل). الحل: قم بتغيير قوة الموجات فوق الصوتية أو طرق أخرى لكسر الخلايا.
  • العينة أو المخزن المؤقت غير مناسب. الحل: تأكد من أن تركيز العامل المخلب ، والعامل المختزل ، والإيميدازول في المخزن المؤقت ليس مرتفعًا جدًا.
  • لم يتم كشف علامته بالكامل. الحل: أضف مادة مذيبة (4-8 م يوريا ، 4-6 م جوانيدين هيدروكلوريد) إلى المخزن المؤقت ، ثم تنقيتها باستخدام وسط IMAC
  • لقد فقدت علامته. الحل: إذا لزم الأمر ، قم بزيادة عدد كتابه وتأكد من التعبير الصحيح ، مع تقليل سرعة التحميل لضمان وقت حضانة كافٍ.

(2) يصعب التخلّص من بروتين علامته على الوسط

  • السبب المحتمل: حالات الشطف خفيفة للغاية. الحل: زيادة تركيز الإيميدازول المزال أو خفض الرقم الهيدروجيني.
  • السبب المحتمل: يترسب البروتين في الوسط. الحل: تقليل حمل العينة وتحسين ظروف اللوني.
  • السبب المحتمل: ملزم غير محدد. الحل: أضف 2٪ Triton X-100 و NaCl إلى المخزن المؤقت.

(3) ذروة الشطف بها العديد من الشوائب

الأسباب المحتملة: الربط غير المحدد ، التنظيف غير الكامل ، التدهور ، إلخ. الحل: في عملية التنقية ، أضف مثبطات البروتين لمنع التحلل ، واغسل جيدًا بعد التحميل ، وأضف كمية معينة من كلوريد الصوديوم وإيميدازول لتقليل الارتباط غير المحدد.

(4) بعد عدة مرات من الاستخدام ، يتم تقليل كفاءة ربط الوسائط وكفاءة العمود

السبب المحتمل: ترسب كمية كبيرة من الشوائب على الوسط. الحل: التنظيف الشامل ، معالجة تجديد النيكل من IDA / IMAC.



فقط من خلال اختيار طريقة تعبير وتنقية مناسبة للبروتين يمكننا الحصول على بروتين مؤتلف عالي النقاء. يمكن استخدام عدد كبير من البروتينات المؤتلفة المنقاة في سلسلة من المجالات الطبية الحيوية مثل فحص الأدوية ، وأبحاث البيولوجيا الهيكلية ، وأبحاث بيولوجيا الخلية ، والبروتيوميات.

نجحت شركة General Biosystems في بناء منصة كاملة لنظام التعبير عن بروتين E. coli بدائية النواة وخلايا الخميرة ، ويمكن أن توفر مجموعة كاملة من الخدمات من بناء بلازميد تعبير البروتين ، واستكشاف شروط التعبير عن البروتين وتنقية تعبير البروتين وفقًا لاحتياجات العملاء.