الصفحة الرئيسية > أخبار > اخبار الصناعة

مزايا طرق تنقية البروتين

تحديث الوقت : 2020-12-09

المصدر:

الآراء : 29

مزايا طرق تنقية البروتين

سواء كان بحثًا أو تطبيقًا على البروتين ، فمن الضروري عادةً التعبير عن البروتين في أنظمة بيولوجية مختلفة (مثل الإشريكية القولونية ، والخميرة ، وفيروسات الحشرات ، ونظام التعبير عن بروتين خلايا الثدييات ، وما إلى ذلك) ، ثم فصله وتنقيته. تحتاج مختبرات الأبحاث عادةً إلى تنقية ميكروغرام أو مليغرام من البروتين ، بينما تحتاج الصناعة إلى تنقية آلاف الجرامات أو حتى أطنان من البروتين.


Mammalian cell protein

لذلك ، فإن تنقية البروتين مهمة للغاية. أثناء عملية التنقية ، يجب مراعاة تلوث العائل وقابلية ذوبان العينة وسلامة بنية البروتين والنشاط البيولوجي. يمكن تقسيم تنقية البروتين تقريبًا إلى ثلاث مراحل: التقاط العينة ومرحلة التنقية المتوسطة ومرحلة التنقية الدقيقة.

أخذ العينات: الفصل والتركيز ومعالجة التثبيت ؛

تنقية معتدلة: لإزالة الحمض النووي والمكونات الخلوية الأخرى ، يمكن استخدام طريقة ترسيب كبريتات الأمونيوم ؛

التنقية الدقيقة: تمييز البروتين المستهدف عن البروتينات الأخرى ذات الحجم والخصائص الفيزيائية والكيميائية المماثلة. تشمل الطرق الشائعة كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني وكروماتوغرافيا التقارب.

دليل تنقية البروتين:


1. أهداف واضحة ، وتجنب الإفراط في التنقية أو التنقية غير الكافية ؛
2. تحديد خصائص العينة والشوائب الرئيسية واختيار طريقة التنقية المناسبة.
يمكن تحديد مزيج تقنية التنقية بسرعة من خلال الكشف عن نافذة استقرار البروتين (مثل قيمة الأس الهيدروجيني والقوة الأيونية) وبيانات البروتين الأساسية (مثل حجم البروتين ونقطة متساوية الكهربي والكره للماء وقابلية الذوبان وما إلى ذلك).

3. يمكنها الكشف بسرعة عن معدل الاسترداد ، النشاط والشوائب للبروتين.

4. التقليل من الخطوات لتجنب فقد العينات المفرط والانخفاض المفرط في النشاط ؛

5. إزالة الأنزيم البروتيني والشوائب الأخرى التي قد تتلف العينة في أسرع وقت ممكن ؛

6. قلل من استخدام المواد المضافة ، وإلا فقد يتطلب الأمر خطوات إضافية لإزالة المواد المضافة.
Escherichia coli expression system

مزايا 6 طرق لتنقية البروتين :

نظرًا للخصائص المختلفة للعينات والبروتينات والشوائب الموجودة فيها ، يلزم وجود استراتيجيات مختلفة لتنقية البروتين.

يوجد حاليًا ست طرق لتنقية البروتين: كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي ، كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، تنقية العلامات ، كروماتوغرافيا التقارب ، كروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء ، الرحلان الكهربي ، إلخ. يمكن أيضًا استخدام طرق أخرى لتنقية البروتين ، مثل استخدام الاستقرار الحراري ، استقرار التحلل البروتيني وقابلية الذوبان للبروتين لتنقية البروتين.


1 كروماتوغرافيا بالترشيح الهلامي

كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي هي طريقة فعالة لفصل البروتين وتنقيته والتي تفصل مخاليط البروتين بناءً على الاختلافات في الحجم الجزيئي.

عندما يمر محلول البروتين عبر عمود كروماتوغرافيا لترشيح الهلام يحتوي على جزيئات معبأة ، لأن البروتينات المختلفة لها أحجام جزيئية مختلفة ، فإن قدرتها على الانتشار إلى جزيئات ذات حجم وحجم مسام معين مختلفة أيضًا.

يتم التخلص من البروتينات الكبيرة أولاً ، ويكون الوزن الجزيئي أصغر. ، فيما بعد الشطف ، وذلك لتحقيق الغرض من فصل البروتين وتنقيته. بشكل عام ، كلما كان عمود كروماتوغرافيا ترشيح الهلام أرق وأطول ، كان تأثير التنقية أفضل.


تتميز هذه التقنية بالعديد من المزايا: فهي لطيفة ، ولا يتم تغيير طبيعة العينة بسهولة ، وبالكاد يكون لها أي تأثير مع البروتين ، ولديها قابلية تكرار جيدة ، ولا تستخدم مذيبات عضوية ، ولها معدل استرداد مرتفع.

يمكن استخدام هذه الطريقة لتنقية البروتين والوزن الجزيئي وتحديد نطاق توزيعه واستبدال المخزن المؤقت وتحلية المياه وما إلى ذلك.


2 كروماتوغرافيا التبادل الأيوني

كروماتوغرافيا التبادل الأيوني هي تقنية لفصل البروتينات وتنقيتها بناءً على نوع وكمية وتوزيع الشحنات على سطح البروتين. في ظل ظروف معينة ، يمكن دمج البروتينات ذات الشحنة النقطية مع عمود التبادل الكاتيوني / الأنيون وإظهار قوة ربط. فرق.

الارتباط قابل للانعكاس ، ويتم استخراجه تدريجيًا بترتيب الارتباط الضعيف إلى القوي أثناء كروماتوغرافيا التبادل الأيوني لتحقيق فصل البروتين وتنقيته.

تتميز هذه التقنية بمزايا الدقة العالية ، والقدرة العالية على تبادل البروتين ، والتطبيق المرن ، ومبدأ الفصل الواضح ، والتشغيل البسيط ، وما إلى ذلك.

إنها مناسبة للتطبيقات المختبرية والصناعية ، بينما يصعب تحقيق ترشيح الهلام في التطبيقات الصناعية.


3 كروماتوغرافيا التقارب

يستخدم كروماتوغرافيا التقارب الامتزاز القابل للانعكاس للجزيئات البيولوجية الكبيرة والروابط لفصل البروتينات وتنقيتها. تتميز هذه الطريقة بمزايا الخصوصية العالية ، والظروف المعتدلة ، والسرعة العالية ، والكفاءة العالية ، وما إلى ذلك ، وهي مناسبة لتنقية البروتينات المستهدفة من العينات المعقدة والعينات ذات المحتوى العالي من الشوائب.

يمكن استخدام الامتصاص المحدد للبروتين المستهدف والرابط ، أو يمكن استخدام الارتباط المحدد بين الملصق والرابط لتحقيق فصل البروتين وتنقيته عن طريق إضافة علامة.


4 تنقية العلامة

يستخدم تنقية العلامات تقنية إعادة التركيب الجيني لإضافة عدد قليل من الأحماض الأمينية الإضافية إلى النهاية الأمينية أو الكربوكسيلية للبروتين كعلامة ، مما يسهل الفصل والتنقية. تشمل العلامات الشائعة GST و His و MBP و Strep-tag ™ II وما إلى ذلك.

علامة GST: أضف glutathione S transferase (GST) إلى تسلسل البروتين ، ثم استخدم Glutathione Sepharose 4B لتنقية التقارب ، واقطعه بالثرومبين أو العامل Xa. هذه الطريقة لها ظروف معتدلة ويمكن أن تحافظ على مولد المضاد ووظيفة البروتين المستهدف.

علامته: الهيستيدين (His) هو أحد العلامات الشائعة ، لأن الهيستدين صغير جدًا ولا يؤثر على وظيفة ونشاط وبنية البروتين المستهدف. أضف 6-10 هيستيدين إلى الأحماض الأمينية.

في ظل ظروف تغيير الطبيعة ، نظرًا لأنه يمكن أن يرتبط بإحكام بعمود مخلب Ni2 + ، يتم التصفية منه باستخدام إيميدازول لتحقيق فصل البروتين وتنقيته.


5 كروماتوغرافيا تفاعل كارهة للماء

مبدأ كروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء هو: في ظل القوة الأيونية العالية ، ينحل البروتين في نظام الماء المالح جزئيًا ، وتتعرض المجموعات الداخلية الكارهة للماء.

يمكن أن يكون لهذه البقايا تفاعلات عكسية كارهة للماء مع المجموعات الوظيفية الكارهة للماء في الوسط. عندما يتم تقليل تركيز الأيونات ، تختفي المجموعة الكارهة للماء من البروتين ، ويختفي التأثير ، ويكتمل الشطف.

نظرًا لاختلاف القوى الكارهة للماء بين البروتينات المختلفة والروابط الكارهة للماء في الوسط ، يمكن فصل البروتينات وتنقيتها. الطريقة منخفضة التكلفة ، ويمكنها الاحتفاظ بالنشاط البيولوجي للبروتين ، وتستخدم على نطاق واسع.


6 الكهربائي

مبدأ الفصل الكهربائي لفصل البروتينات وتنقيتها هو أنه تحت تأثير المجال الكهربائي ، تتحرك الجسيمات الغروية المنقطة باتجاه القطب مع خصائص كهربائية معاكسة ، وكلما كان الجزيء أكبر ، كانت سرعة الحركة أبطأ.

يمكن استخدام SDS-PAGE لفصل وتنقية البروتينات. يمكن تطوير البروتين عن طريق عوامل التلوين. الميزة هي أنها سهلة التشغيل واقتصادية وبديهية ؛ العيب هو أنه لا يمكن استخدامه على نطاق واسع.