الصفحة الرئيسية > أخبار > اخبار الصناعة

خصائص نظام التعبير E. coli

تحديث الوقت : 2020-12-10

المصدر:

الآراء : 27

خصائص نظام التعبير E. coli

الإشريكية القولونية هي أول بكتيريا مضيفة تستخدم للتعبير عن البروتين المؤتلف. حتى الآن ، لا تزال الإشريكية القولونية تعتبر الأداة الرئيسية في مجال التعبير عن البروتين. وقت تكاثر الإشريكية القولونية قصير نسبيًا ، لذلك يصبح نظام التعبير عن الإشريكية القولونية طريقة سريعة. عادةً ما يستغرق التعبير عن الجينات المؤتلفة في الإشريكية القولونية أقل من أسبوع واحد فقط.

في الوقت نفسه ، يتمتع نظام التعبير عن الإشريكية القولونية أيضًا بميزة السعر المنخفض - وسط استزراع الإشريكية القولونية.

E. coli Protein  Expression System

مشتمل

في الإشريكية القولونية ، توجد البروتينات المؤتلفة عادةً في السيتوبلازم ، ويمكن أيضًا أن توجد في محيط البلازم ، وفي حالات قليلة سيتم إفرازها خارج الخلية. تعد كفاءة التعبير عن البروتينات الموجودة في السيتوبلازم هي الأعلى ، ويمكن أن يمثل العائد عادةً 30 ٪ من إجمالي الكتلة الحيوية.

ومع ذلك ، قد يؤدي الإفراط في التعبير عن البروتين المؤتلف إلى تراكم مجاميع البروتين غير القابلة للذوبان ، وبالتالي تكوين أجسام متضمنة.


ليست البروتينات المشتقة من حقيقيات النوى فقط هي التي تشكل أجسامًا متضمنة ، ولكن في حالات قليلة ، يمكن أيضًا أن يشكل الإفراط في التعبير عن البروتينات المشتقة من بدائيات النوى مثل الإشريكية القولونية أجسامًا متضمنة.

في E. coli ، يكون معدل ترجمة البروتين والطي أعلى بنحو 10 مرات من مثيله في الخلايا حقيقية النواة ، وهو ما قد يكون السبب في أن البروتينات حقيقية النواة تشكل أجسامًا متضمنة. في بعض الحالات ، تعيق أجسام التضمين بشكل كبير توافر البروتين النشط القابل للذوبان.


تتمتع هيئات الدمج أيضًا بمزايا معينة. عادة ، لا تتحلل الأجسام المتضمنة بسهولة بواسطة البروتياز ، ويسهل تركيزها عن طريق الطرد المركزي ، ونادرًا ما تتلوث ببروتينات أخرى. من خلال وسائل معينة ، يمكن أيضًا إعادة تشكيل أجسام التضمين إلى بروتينات نشطة قابلة للذوبان.
E. coli Protein  Expression System

تقلل درجة الحرارة والمرافقون الجزيئي من تكوين أجسام التضمين


يسمح خفض درجة الحرارة إلى 15-30 درجة مئوية أثناء التعبير البروتيني للبروتين المؤتلف بتكوين أكبر قدر ممكن من البروتين المطوي بشكل صحيح ، مع تكوين أقل عدد ممكن من الأجسام المتضمنة.

تظهر بعض التكهنات أن خفض درجة الحرارة سيقلل من معدل نسخ البروتين وترجمته وطيّه ، بحيث يمكن أن ينثني البروتين بشكل صحيح. في الوقت نفسه ، ستقلل درجة الحرارة المنخفضة أيضًا من نشاط بروتياز الصدمة الحرارية.


بالإضافة إلى ذلك ، يعزز بعض الباحثين قابلية ذوبان البروتينات من خلال التعبير المشترك عن المرافق مع البروتينات المؤتلفة في السيتوبلازم. قد يكون استخدام المرافق الجزيئية خاصًا بالبروتين ، لذلك يجب إجراء التجارب بشكل منفصل لكل بروتين مستهدف مؤتلف.

تعمل علامات الانصهار على تحسين قابلية ذوبان البروتينات المؤتلفة


هناك طريقة أخرى لتحسين قابلية ذوبان العديد من البروتينات المؤتلفة وهي دمج علامة اندماج قابلة للذوبان في الطرف N أو الطرف C للبروتين المؤتلف.

علامات الانصهار التي ثبت أنها تحسن قابلية ذوبان البروتينات المؤتلفة تشمل الجلوتاثيون S ترانسفيراز مثل ثيوردوكسين ، بروتين ربط المالتوز (MBP) ، جزيء صغير يشبه البروتين المعدل وعلامة NusA (ركيزة استخدام JV).


من بينها ، علامة GST وعلامة MBP لها فوائد إضافية ، ويمكن استخدامها كعلامات تنقية التقارب. لسوء الحظ ، لا يمكن تطبيق علامة واحدة على جميع البروتينات المؤتلفة ، ويجب تقييم قدرة علامات الاندماج المتعددة على تعزيز التعبير القابل للذوبان.


هناك العديد من الاستراتيجيات لإزالة علامة الانصهار للبروتين المؤتلف. تتمثل الطريقة المعتادة في إدخال موقع انقسام البروتياز بين علامة الاندماج والبروتين المؤتلف ، ثم استخدام بروتياز معين لإزالته.

ومع ذلك ، في بعض الأحيان قد يصبح البروتين المؤتلف غير قابل للذوبان بعد إزالة الملصق ، لذلك يجب اختبار هذه الطريقة بعناية.


تشكيل رابطة ثاني كبريتيد


للتعبير السيتوبلازمي ، لا تستطيع الإشريكية القولونية عادة تعزيز التكوين الصحيح لروابط ثاني كبريتيد البروتينات المؤتلفة ؛ نظرًا لوجود محفز لنظام أوكسيريدوكتاز برابطة ثاني كبريتيد ، فإن الطبقة المحيطة هي عادة المكان الوحيد الذي يمكن أن تتشكل فيه روابط ثاني كبريتيد في الإشريكية القولونية.

لذلك ، إذا كان البروتين المؤتلف يحتاج إلى تكوين روابط ثنائي كبريتيد ، فيجب استخدام ببتيد إشارة قابل للانقسام (مثل pelB) لتحديد موقعه في محيط البلازم. ومع ذلك ، فإن أحد العيوب الرئيسية للتعبير periplasmic هو أن كمية تعبير البروتين سيتم تقليلها بشكل كبير.


يمكن أن يعزز Thioredoxin و glutaredoxin رد فعل الاختزال لحمض الهيميبتيرانيك في السيتوبلازم ، ويدمران جين اختزال ثيوردوكسين ومجموعة اختزال الجلوتاثيون في نظام D sb من خلال تعديل جينوم الإشريكية القولونية ، ويمكن أن يخلق بيئة أكثر ملاءمة لتشكيل رابطة ثاني كبريتيد في السيتوبلازم.

تم تسويق هذه السلالات المعدلة وراثيًا بواسطة EMI> Novagen. في حالة الحاجة إلى تكوين المزيد من روابط ثاني كبريتيد ، يمكن دمج البروتين المؤتلف مع thioredoxin والتعبير عنه في سلالة trxB- / gor E. coli.