استراتيجيات الاستنساخ الفرعي الشائعة

لدراسة الوظيفة المرغوبة للإدخال ، هناك حاجة لنقلها من متجه إلى آخر ، يُعرف إجراء النقل هذا بالاستنساخ الفرعي . خطوات الاستنساخ الفرعي:

• قم بتحرير وتنقية الإدخال الخاص بك من المتجه الأصل
• اربط هذا الإدخال في متجه وجهة معدة
• قم بتحويل تفاعل الارتباط هذا إلى خلايا بكتيرية مختصة
• فحص الخلايا المحولة للإدراج

استراتيجيات الاستنساخ الفرعي المختلفة ：

لأي عمل على الاستنساخ الفرعي ، من الضروري وجود بعض المعرفة المسبقة حول المتجه والإدخال.

المعلومات حول مواقع RE المتوفرة في مناطق الاستنساخ المتعددة المتجهية الأصل ، تتوفر مواقع RE المضمن (في حالة الهضم الداخلي). أيضًا معلومات حول تكرار مواقع الطاقة المتجددة في متجه الوجهة متعدد مناطق الاستنساخ ومواقع RE في الملحق.

اعتمادًا على التركيبة المختلفة لهذه المواقع ، يتم تحديد استراتيجية الاستنساخ الفرعي التي سيتم استخدامها.

✦ مواقع التقييد المشتركة

يمكن استخدام عملية استنساخ فرعي مباشرة إذا احتوت مناطق الاستنساخ المتعددة المتجهية والوجهة على مواقع تقييد مشتركة ولم يحدث أي من مواقع التقييد هذه ضمن إدخالك.

يتم هضم كل من ناقلات الأصل والوجهة باستخدام نفس الإنزيمين. ويتبع ذلك نزع الفسفرة من ناقل الوجهة. افصل بين كل من الإدخال وناقل إزالة الفسفرة باستخدام هلام الاغاروز. ثم تنقية ناقل الإدخال باستخدام أي نظام تنقية للحمض النووي. أخيرًا ، يتم ربط هذه النواقل والإدخالات.

✦ نقل الإدخالات باستخدام مواقع تقييد متوافقة

  هناك حالات عندما تكون مواقع التقييد في مناطق الاستنساخ المتعددة في الأصل والمتجه الوجهة غير شائعة ولكنها قد تكون متوافقة. مواقع التقييد المتوافقة لها نفس التسلسل المتراكم ويمكن ربطها معًا.

بعد الربط ، لا تشبه المواقع المجددة كلاً من مواقع التقييد في مناطق الاستنساخ المتعددة والمتجه الأصل والوجهة. بمجرد تحديد الإنزيمات اللازمة للربط والتقييد. تصبح استراتيجية الاستنساخ هذه واضحة ومباشرة.

يؤدي الجمع بين مواقع التقييد الشائعة إلى إمكانية تطابق واحد فقط على جانب واحد من الإدخال. يجب معالجة القضية على الجانب الآخر من الملحق. يمكن استخدام قطع غير حاد.

يمكن أن يؤدي عمل T4 DNA Polymerase إلى إضعاف أي موقع تقييد. هضم المتجه الأصل وقلل هذا الموقع باستخدام T4 DNA Polymerase. قم بتشغيل المنتجات على هلام ، وتنقيته والمضي قدمًا في عملية هضم إنزيم التقييد المشترك أو المتوافق.

تحتوي معظم النواقل على موقع تقييد واحد على الأقل غير حاد الأطراف يمكنه قبول النهاية الحادة المنشأة حديثًا من الإدخال.

إذا لم يكن لديك مثل هذا الموقع أو إذا لم يكن الموقع في الاتجاه الصحيح ، فقد يتم تطبيق نفس استراتيجية "cut-blunt-cut" على الوجهة.

✦ طريقة بلانت-إند

السيناريو النهائي لعدم وجود موقع تقييد مشترك شائع أو متوافق مع المتجه الأصل أو الوجهة.

في هذا السيناريو ، تتمثل أفضل استراتيجية في تضخيم الإدخال مع مواقع التقييد في البادئات لتوفير التوافق. لكن هذه الطريقة لها مجموعة خاصة من المشاكل.

هناك احتمال حدوث طفرات. أيضا ، هناك صعوبة كبيرة في هضم منتجات PCR. يمكن استخدام إستراتيجية أخرى في هذا السيناريو. قطع الملحق بأي إنزيمات.

تعامل مع T4 DNA Polymerase لتخفف من 5 ′ أو 3 المتدلية وربطها في ناقل الوجهة المفتوح بقاطع نهاية حادة أو جعله غير حاد بواسطة T4 DNA Polymerase. قد لا يتم الاحتفاظ بتوجيه الجرة بهذه الطريقة.