العوامل المؤثرة على تعبير البروتين

عند إجراء تجارب التعبير عن البروتين ، تشعر التجربة أحيانًا أنه لا توجد مشكلة في طريقة التجربة المرجعية وتسلسل جين البروتين المستنسخ ، ولا ينتج عن الفصل الكهربائي للبروتين أية نتائج.

تم تلخيص أسباب عدم التعبير عن البروتين.

2. الاختيار غير السليم للبكتيريا المضيفة. البكتيريا المضيفة المختلفة لها أنماط وراثية مختلفة.

بالنسبة لبعض النواقل المعدلة بشكل خاص ، أو ناقلات الأغراض الخاصة ، أو النواقل ذات المحفزات الخاصة ، يجب اختيار البكتيريا المضيفة المناسبة للتعبير.

لذلك ، عندما لا يتم التعبير عن البروتين الخاص بك ، يمكنك التفكير في استبدال البكتيريا المضيفة.

4. البلازميد غير مستقر أو مفقود. عادة ما تكون أنظمة PET مستقرة نسبيًا. ولكن عندما تختار ناقلًا ذو مقاومة للأمبيسيلين ، فقد يكون من الممكن إنتاج بيتا-جالاكتوزيداز الذي يحط من المضاد الحيوي ويفقد البلازميد.

حالة أخرى هي التعبير عن بروتين التوكسين المؤتلف ، وهو سام أيضًا للخلايا المضيفة ، مما يتسبب في فقد البلازميد. هذا الموقف أكثر شيوعًا في أنظمة التعبير حقيقية النواة.

5. البروتياز يحط من البروتين. غالبًا ما يحدث هذا الموقف بسبب التسلسل الطرفي N أو C للبروتين المؤتلف نفسه. عندما تكون محطة N للبروتين هي Arg أو Leu أو Lys أو Phe أو Trp أو Tyr ، فإن هذه الأحماض الأمينية تكون عرضة لتحلل البروتياز ، وهي قاعدة N-terminal.

عندما يتم استيفاء الطرف N ، يمكن للإشريكية القولونية أن تسرق هذا Met بهدوء ، خاصة عندما يتبع Met بحمض أميني بسلسلة جانبية صغيرة.

يمكن أن يؤدي وجود الأحماض الأمينية غير القطبية في الطرف C بسهولة إلى تدهور البروتين. الأحماض الأمينية الخمسة الأخيرة في الطرف C قطبية أو مشحونة ولا تتحلل بسهولة.

6. موقع بدء الترجمة الثانوية. هذا هو الحال عندما يحدث أن يحتوي التسلسل الخاص بك على نفس التسلسل تمامًا مثل موقع ربط الريبوسوم.

سيجد الريبوسوم هذا الموقع ويبدأ في الترجمة ، مما يتسبب في اقتطاع البروتين ، ولا يمكن رؤية أجزاء بالحجم المتوقع أثناء الرحلان الكهربائي.

7. تسلسل SD. المسافة بين تسلسل SD وتسلسل كود البدء (80٪ هي AUG و GUG) لها أيضًا تأثير مهم جدًا على كفاءة تعبير البروتين.

يؤثر تكوين تسلسل SD نفسه أيضًا على كفاءة الترجمة. في بعض الأحيان لتقليل إنتاج هيئات التضمين ، يتم تعديل تسلسل SD بشكل خاص!

9. إنهاء غير متوقع. وينظر إلى هذا الوضع في تضخيم تسلسل PCR. على سبيل المثال ، سوف يقوم بتحويل TAC في منتصف التسلسل إلى TAA ، مما سيؤدي إلى تعطيل ترجمة البروتين الخاصة بك.

لذلك ، يجب إجراء التسلسل قبل التعبير لتجنب هذا الموقف.

10. فاصل النسخ. يمكن أن يؤدي وجود فاصل النسخ إلى تعزيز تعبير البروتين ؛ ولكن في حالة عدم توفرها ، سيؤدي ذلك إلى "قراءة" وقراءة ما لا نهاية.

هذه ليست مشكلة في نظام PET لأنه يحتوي على جين محدد انتقائي في الاتجاه المعاكس للجين المستهدف.

إذا حدث أن يكون الجين المستهدف في نفس اتجاه جين العلامة هذا ، فعليك أن ترى ما إذا كان هناك فاصل نسخ بعد الجين المستهدف.

11. عدم استقرار مرنا. غالبًا ما يتراكم الرنا المرسال للجين المستهدف في الخلية. لكن الرنا المرسال للبكتيريا القولونية غير مستقر للغاية.

إذا تم إدخال تسلسل هيكلي مستقر في المنطقة 5 'غير المترجمة و 3'-rho-مستقل إنهاء من mRNA ، يمكن تعزيز استقرار mRNA.

خاصة إذا كان للجزء 5'end بنية دبوس الشعر بدون جاحظ ، فيمكن أن يجعل mRNA غير حي في السيتوبلازم.

12. جدوى طريقة الكشف. في بعض الأحيان ، يتم التعبير عن البروتين بالفعل ، ولكن مستوى التعبير منخفض للغاية ، أو أنه قريب جدًا من النطاق المتنوع بحيث تعتقد خطأً أنه لا يتم التعبير عن البروتين.

في هذا الوقت ، يجب ألا تنسى القاعدتين الذهبيتين للتجارب البيولوجية: التحكم والتكرار.

باختصار ، أي مواد تجريبية مهمة جدًا. البناء الصحيح لناقلات التعبير البروتيني هو أساس تجارب التعبير البروتيني.

لذلك ، يجب ضمان صحة نواقل التعبير عن البروتين. البكتيريا المضيفة المناسبة هي أيضًا أساس تجارب التعبير عن البروتين.