الصفحة الرئيسية > أخبار > اخبار الصناعة

أربع طرق للاستنساخ الفرعي

تحديث الوقت : 2020-08-06

المصدر:

الآراء : 82

أربع طرق للاستنساخ الفرعي
من وجهة نظر شركة متخصصة في استنساخ فرعي الخدمات ، generalbiosystems سوف توفر لك مع إجابات على النهج المستخدمة من قبل استنساخ فرعي.

✦ تقييد الهضم

نوكليازات التقييد (RE) ، والتي يشار إليها أيضًا باسم إنزيمات التقييد ، هي بروتينات تحدد سلاسل الحمض النووي القصيرة والتفاصيل (عادةً ما تكون متناظرة). النوع الثاني من REs يشق الحمض النووي مزدوج الشريطة (dsDNA) في مواقع ويب معينة داخل أو بجانب تسلسل التعرف عليها.

من المؤكد أن الكثير من إنزيمات التقييد لن تقلل من الحمض النووي الميثلي على أحد الشعرين أو كليهما في موقع الإقرار ، على الرغم من أن البعض يدعو إلى استخدام مثيلة الركيزة.


الهضم الجزئي

التحكم في تكرار القطع في الهضم المقيد

رؤية موقع التعرف على القيود في الملحق وكذلك منطقة الاستنساخ المتعددة لا تمنع بالضرورة استخدام موقع التقييد هذا في تقنية استنساخ فرعي. في ظل ظروف امتصاص التقييد النموذجية ، يكون الإنزيم زائدًا للتأكد من إمكانية شق جميع مواقع التعرف في البلازميد.

يمكنك التعامل مع شروط هضم القيد بحيث لا تهضم بالتأكيد سوى جزء من مواقع الويب.

تم بالفعل استخدام العديد من الطرق لإجراء عمليات هضم جزئية: تقليل مستوى درجة حرارة التفاعل ، والاستفادة من حاجز غير مثالي ، وخفض أنظمة الإنزيم.


ناقلات إزالة الفسفرة للحد من الارتباط الذاتي

يعد إيقاف الربط الذاتي للمتجهات أمرًا ضروريًا لتقليل تاريخ الاستنساخ الفرعي. تعد كفاءة ربط البلازميد بنفسه أفضل بكثير من ربط قطعة منفصلة من الحمض النووي مباشرة في المتجه وهي الاستجابة المفضلة. التخلص من 5 ′ فوسفات للناقل الخطي سيوقف T4 DNA Ligase من إعادة تدوير المتجه. إنزيم الفوسفاتاز القلوي المعوي في العجل هو الإنزيم الخالد لنزع الفسفرة الناقل.

يمكن الاستفادة من الإنزيم في نهايات 5 5 راحة (أي ينشأ من إنزيم يترك 3 ′ متدلية) ، و 5 ′ متدلية وكذلك غير حادة.

بعد إزالة الفسفرة ، يجب التخلص من الإنزيم إما عن طريق التنقية المباشرة أو الرحلان الكهربي للهلام وأيضًا عزل الهلام باستخدام أنظمة ترشيح الحمض النووي مثل Gel و PCR Clean-Up System.

يمكن استخدام فوسفاتاز الروبيان القلوي بدلاً من عظام العجل القناة المعوية القلوية الفوسفاتيز وكذلك يوفر ميزة تمسخ بسيط للدفء لتعليق الإنزيم دون الحاجة إلى مزيد من الترشيح.


تنقية ناقلات وكذلك إدراج

ترشيح الإدخال بالإضافة إلى متجه الموقع ضروريان للغاية للنجاح في تطبيقات الاستنساخ الفرعي.

منذ سنوات ، كانت كل خطوة تتطلب الفينول: استخلاص الكلوروفورم يلتزم به هطول الأمطار للإيثانول للتخلص من الإنزيمات مثل الفوسفاتيز القلوي الهضمي من ضوابط مكافحة ناقلات المواد الكيميائية.

نظم تنظيف الحمض النووي القائمة على الجوانيدين تبسيطًا كبيرًا في التخلص من الإنزيمات.

عززت طرق عزل الهلام بشكل أكبر من فعالية الاستنساخ الفرعي عن طريق فصل المحفزات المطلوبة عن المواد المتفاعلة غير المرغوب فيها.