الصفحة الرئيسية > أخبار > أخبار الشركة

طرق التوليف الجيني

تحديث الوقت : 2020-08-25

المصدر:

الآراء : 74

طرق التوليف الجيني

تتضمن طرق التوليف الجيني بشكل أساسي تجميع PCR ، وتمديد تداخل PCR ، وطريقة TBIO ، وطريقة PTDS.


全球 基因 合成 服务 市场 综述 - 科技 频道 - 手机 搜狐


قبل تخليق الجينات ، من أجل السماح بالتعبير الجيد للجينات في أنظمة التعبير البيولوجي المختلفة ، يقوم الباحثون عادة بتحسين الكودون على الجينات.

هناك 64 رمزًا جينيًا ، لكن معظم الكائنات الحية تميل إلى استخدام بعض هذه الكودونات. تلك التي يتم استخدامها بشكل متكرر تسمى الأكواد المثلى ، وتلك التي لا يتم استخدامها بشكل متكرر تسمى الأكواد النادرة أو قليلة الاستخدام.


في الواقع ، يُظهر كل كائن حي يستخدم لتعبير البروتين أو إنتاجه (بما في ذلك الإشريكية القولونية والخميرة وخلايا الثدييات والخلايا النباتية وخلايا الحشرات) درجة معينة من تفضيل الكودون.

لذلك ، قد يتأثر التعبير عن البروتينات المؤتلفة بالكودونات. تأثير استخدام الطفل (خاصة في أنظمة التعبير غير المتجانسة).


بدون تغيير بروتين الترميز الخاص به ، فإن عملية تغيير جين الترميز للبروتين ، وإزالة الكودونات النادرة ، وتحسين البنية الثانوية لـ mRNA ، ومحتوى GC ، وما إلى ذلك تسمى تحسين الكودون.

يتمثل مبدأ تحسين الكودون في تحديد أكواد مختلفة لكل حمض أميني في تسلسل البروتين المستهدف وفقًا لتفضيل الكودون لنظام التعبير المراد استخدامه لأداء مجموعة من التسلسل بأكمله والعثور على أفضل واحد.


1. التوليف التمهيدي
بعد أن يحدد الباحثون تسلسل الجينات الاصطناعية وفقًا لرغباتهم الخاصة ، نظرًا لعدم وجود قالب ، يحتاجون أولاً إلى تصميم وتوليف البادئات بناءً على الحمض النووي مزدوج الشريطة المراد تصنيعه.
في الوقت الحاضر ، يعتمد تخليق التمهيدي بشكل أساسي على طريقة الفوسفوراميديت الثلاثي المرحلة الصلبة. تتميز طريقة الفوسفوراميديت الثلاثية لتجميع شظايا الحمض النووي بخصائص الكفاءة العالية والاقتران السريع والمتفاعلات الأولية المستقرة نسبيًا.
2. تضخيم PCR مع الاشعال كقوالب
بعد تصنيع البادئات ، تعمل البادئات كقوالب لتضخيم PCR. يشبه المبدأ الأساسي لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل عملية النسخ الطبيعي للحمض النووي ، وتعتمد خصوصيتها على بادئات قليلة النوكليوتيد المكملة لكلا طرفي التسلسل المستهدف.
3. تحويل الاتصال ، فحص البكتيريا واختبارها
من خلال تفاعل PCR ، يمكن تضخيم الحمض النووي المزدوج الذي نحتاجه. لكن استقرار منتج PCR منخفض ، فنحن بحاجة إلى ربطه بالبلازميد ، وتحويله إلى حالة مختصة ، ونشره على طبق بين عشية وضحاها. يمكن التقاط النسخ الإيجابية من الطبق في صباح اليوم التالي. يجب التحقق من الحيوانات المستنسخة المختارة بواسطة مستعمرة PCR مرة أخرى للتحقق مما إذا كان هناك إدخال جيني كامل الطول. يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات الرأس والذيل. إذا كان هناك منتج ، فهذا يشير إلى وجود جين مستهدف. يتم تحويل الحيوانات المستنسخة التي تم التحقق منها إلى بكتيريا تهز ثقافة أنبوب الاختبار ، وبعد ذلك يتم استخراج البلازميدات وتنقيتها وإرسالها للتسلسل.
4. الجيل الأول من التسلسل
حاليًا ، نستخدم تسلسل الجيل الأول ، ويسمى أيضًا تسلسل سانجر. يستخدم تسلسل سانجر بوليميريز DNA لتمديد مادة أولية مرتبطة بقالب من تسلسل معلق حتى يتم دمج سلسلة إنهاء النيوكليوتيد. يتكون كل تحديد تسلسل من مجموعة من أربعة تفاعلات منفصلة ، كل منها يحتوي على جميع ديوكسينوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dNTPs) ، ممزوجًا بكمية محدودة من ثلاثي فوسفات ديوكسينوكليوتيد مختلف (ddNTP).
5. التحقق من مراقبة الجودة

تتم مقارنة نتيجة التسلسل مع الجين المستهدف ، ويتم إجراء التحقق من هضم إنزيم QC في نفس الوقت. إذا كانت نتيجة التسلسل ونتائج التحقق من الهضم صحيحة ، يتم الانتهاء من تخليق الجين المستهدف. وفقًا للخطوات المذكورة أعلاه ، يمكن تصنيع تسلسل جيني يبلغ حوالي 800 نقطة أساس في 5 أيام في ظل ظروف سلسة.