الصفحة الرئيسية > أخبار > اخبار الصناعة

كيف تتعامل مع الأجسام المتضمنة في تجارب التعبير البروتيني؟

تحديث الوقت : 2021-01-05

المصدر:

الآراء : 55

كيف تتعامل مع الأجسام المتضمنة في تجارب التعبير البروتيني؟
ما هي المشاكل التي غالبا ما يواجهها التعبير البروتيني؟ هيئات الدمج هي واحدة منهم. بالنسبة لمعظم التجارب ، تكون الأجسام المتضمنة مثل أضلاع الدجاج. ومع ذلك ، غالبًا ما تكون هذه مشكلة يجب التعامل معها في عملية التعبير عن البروتين بدائية النواة.

أفضل طريقة بالطبع هي تجنب ظهور أجسام متضمنة ، ولكن هناك أيضًا العديد من البروتينات التي لا يمكن الحصول عليها في شكل طاف أثناء التعبير بدائية النواة. في هذا الوقت ، تصبح إعادة تكوين الأجسام المتضمنة في بروتينات نشطة هي الخيار الأفضل.
怎样 处理 蛋白 表达 实验 中 出现 的 包涵体?

فصل وغسيل الجثث المتضمنة

تتمتع أجسام الشمول بكثافة أعلى من المكونات الأخرى ، لذلك يمكن جمعها عن طريق الطرد المركزي. بعد معالجة البكتيريا باستخدام الليزوزيم ، عادة ما تتعطل الخلايا عن طريق التجانس عالي الضغط.

نظرًا لأن الجسيمات الشحمية وأغشية الخلايا المكسورة جزئيًا وبروتينات الغشاء قد تلتصق بأجسام التضمين ، يجب غسل أجسام التضمين قبل التمسخ والتفكك ، عادةً بتركيز منخفض من المُحول مثل 0.5-1M غوانيدين هيدروكلوريد أو اليوريا.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكنك أيضًا الغسل بمنظف معتدل 1٪ TritonX-100 أو ديوكسيكولات الصوديوم لإزالة شظايا الأغشية وبروتينات الأغشية.

ضمور الجسم

أعد تعليق واحتضان الهيئات المتضمنة في المخزن المؤقت الذي يحتوي على عامل مذيب ومختزل (عادةً 20 ملي مولار DTT أو β-مركابتوإيثانول). يمكن أن تؤدي إضافة عامل الاختزال إلى إبقاء Cys في حالة مخفضة. يمكنه أيضًا كسر روابط ثاني كبريتيد في البروتينات.

عادة ما يتم الحفاظ على درجة حرارة الحضانة أثناء عملية التمسخ عند 30 درجة مئوية لتعزيز إذابة البروتين. يتم تحديد تحسين الظروف المختلفة في هذه العملية من خلال خصائص البروتين المحدد ، ويمكن إجراء تجربة على نطاق صغير للعثور على أفضل ظروف الذوبان.
怎样 处理 蛋白 表达 实验 中 出现 的 包涵体?
كيف تتعامل مع الأجسام المتضمنة في تجارب التعبير البروتيني؟

فيما يلي الشروط التجريبية للتمسخ بشكل عام:

بعد اكتمال تمسخ أجسام التضمين ، يلزم الطرد المركزي لإزالة المواد غير القابلة للذوبان المتبقية ، وإلا فقد تتسبب المواد غير القابلة للذوبان المتبقية في تراكم البروتين وهطول الأمطار أثناء عملية إعادة تشكيل البروتين المستهدف. من الأفضل استخدام الطرد المركزي الفائق (100000 جم ، 30 دقيقة) للطرد المركزي.

إعادة تشكيل البروتين القابل للذوبان

الخطوة الأولى لإعادة التشبع هي إزالة المُحول. العوامل الرئيسية غير المواتية في عملية تجديد البروتين هي اختلال البروتين وهطول الأمطار.

من أجل منع ترسب البروتين أثناء عملية التجديد ، من الضروري تقليل تركيز البروتين ، ويتم التحكم في نطاق تركيز البروتين في حدود 10-100 مجم / مل.

بالنسبة للبروتينات المختلفة ، يجب تحسين ظروف إعادة التشبع. العوامل المهمة في عملية إعادة التشبع هي كما يلي:
  • تكوين العازلة (درجة الحموضة ، التركيز) ؛
  • درجة الحرارة؛
  • المواد المضافة (عادة ما يتم استخدام العديد من الإضافات معًا).

تتم إزالة عامل تغيير الطبيعة وعامل الاختزال ، ويتم تزويد جزيء البروتين المحوَّل بالبيئة الصحيحة لإعادة التشكيل واستعادة النشاط ، ويمكن الحصول على البروتين الطبيعي النشط. أكثر طرق إعادة التشبع المستخدمة شيوعًا هي غسيل الكلى والتخفيف واللوني وما إلى ذلك.

غسيل الكلى هو الطريقة الأكثر استخدامًا في المختبرات ، ولكنه يستغرق وقتًا طويلاً ويشكل بسهولة تجمعات بروتينية غير نشطة. صممت MaedaY طريقة غسيل الكلى البطيئة ، باستخدام 8mol / L من محلول اليوريا كبداية ، ثم زيادة المحلول الخالي من اليوريا تدريجياً لتقليل تركيز المُحول.

في هذه الطريقة ، يتناقص تركيز المُحول بشكل مستمر وبطء ، ولا توجد طفرة في تركيز المُحول في طريقة التخفيف ، مما قد يساعد في تقليل الترسيب أثناء إعادة تأهيل بعض البروتينات وزيادة إنتاجية البروتينات النشطة. بهذه الطريقة ، وصل معدل إعادة التشبع لـ IgG إلى 70٪ عند 1 مجم / مل.

التخفيف هو أبسط طريقة وأكثر فاعلية لإعادة تشكيلها. بعد التخفيف ، عندما ينخفض عامل الاختزال والتحول إلى تركيز معين ، تبدأ جزيئات البروتين في إعادة الطي ، لكن كمية السائل المعالجة كبيرة ، وهو ما لا يفضي إلى التضخيم الصناعي. تتضمن طرق التخفيف الحالية بشكل أساسي التخفيف لمرة واحدة والتخفيف المجزأ والتخفيف التسلسلي.

إعادة التشبع الكروماتوغرافي هي طريقة إعادة التشبع التي تمت دراستها بشكل متكرر. تُستخدم الأعمدة الكروماتوغرافية لإزالة المُحوِّلات. تتضمن الطرق الاستشرابية الشائعة الاستخدام المناخل الجزيئية وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني وكروماتوغرافيا التقارب.

عندما يهاجر البروتين ببطء في العمود ، يمكن إزالة المُحول ، أو يرتبط البروتين بعمود الكروماتوغرافيا وفصله عن المُحول. عادةً ما يتم استخدام إعادة التشبع الكروماتوغرافي لإعادة تأهيل البروتين على نطاق واسع ، ويتراوح تركيز بروتين إعادة التشبع حتى مجم / مل.


إذا واجهت عددًا كبيرًا جدًا من هيئات التضمين في التجربة ، فيمكنك أيضًا تجربة الطرق المذكورة أعلاه. إذا كنت لا تزال غير قادر على حلها ، فيمكنك أيضًا التفكير في Generalbiosystems لمساعدتك. نحن شركة متخصصة في تحضير البروتين المؤتلف.