الصفحة الرئيسية > أخبار > أخبار الشركة

طريقة تصميم استنساخ PCR التمهيدي

تحديث الوقت : 2020-08-17

المصدر:

الآراء : 84

طريقة تصميم استنساخ PCR التمهيدي

استنساخ PCR هو تقنية بيولوجيا جزيئية تضخّم وتوسع أجزاء معينة من الحمض النووي ، وتستخدم على نطاق واسع في البيولوجيا الجزيئية والمجالات ذات الصلة.

من بينها ، يعد استنساخ PCR التمهيدي عاملاً مهمًا في عملية تفاعل توسع PCR. لذلك ، قبل أن تبدأ تجربة استنساخ PCR رسميًا ، من الضروري إتقان طريقة تصميم تمهيدي استنساخ PCR الصحيح.


عملية تصميم استنساخ PCR:


الحصول على تسلسل جزء امتداد PCR: في الحالة الأولى ، قم بالتوسيع استنادًا إلى الأجزاء المعروفة ، وتحتاج إلى تصميم بادئات تمدد PCR من خلال البحث NCBI عن تسلسل الجينات ؛ في الحالة الأخرى ، قم بتوسيع أجزاء الجينات غير المعروفة ، فأنت بحاجة إلى البحث عن التسلسلات المحافظة للأنواع ذات الصلة ، بناءً على التسلسلات المحافظة DNA أو RNA كقالب لتصميم الاشعال.


على سبيل المثال ، برنامج التصميم التمهيدي Prime Premier 5.0 قوي وسهل الاستخدام. يمكنه مقارنة تصميم البادئات وتقييمه بشكل شامل. إنه أحد البرامج الأكثر استخدامًا لتصميم التمهيدي.


التحقق من اختبار تمديد PCR: يمكن إجراء تضخيم PCR بعد اكتمال تخليق التمهيدي ، ويمكن التنبؤ بصحة بادئات استنساخ PCR بناءً على طول المنتج المضخم بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام.


احتياطات التصميم التمهيدي لاستنساخ PCR:


يتم الحفاظ على طول التمهيدي بشكل أساسي بين 18-24 نقطة أساس. إذا كان طول تسلسل التمهيدي قصيرًا جدًا ، فقد يتمدد ويؤثر على معدل تمدد استنساخ PCR ؛ إذا كان طول التمهيدي طويلًا جدًا ، فلا يمكن زيادة تقليل التمهيدي ، ولكن التسلسل الطويل جدًا سيؤدي إلى عدم التطابق ويقلل من معدل تمدد استنساخ PCR.


لذلك ، فإن قيمة Tm المناسبة هي 55-80 درجة مئوية ، ويجب أن يكون فرق درجة حرارة البدء بين المنبع والمصب في حدود 10 درجة مئوية.

لذلك ، سيؤثر محتوى GC للتمديد على درجة حرارة انصهار قليل النوكليوتيد أثناء عملية استنساخ PCR ، أي قيمة Tm.

بشكل عام ، يتراوح محتوى GC للامتداد بين 40٪ -60٪ ، ويكون اختلاف محتوى GC بين البادئات الأولية والنهائية في حدود 20٪ ، مما قد يؤدي إلى زيادة محتوى التمهيدي.



إذا حدث هذا ، فقد يحدث عدم تطابق أثناء عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما سيؤثر على دقة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.

منع الخيط المفرد من برايم التضخيم من تكوين بنية ثانوية أثناء عملية استنساخ PCR وتثبيط عملية توسيع PCR.


تستخدم منصة Generalbiosystems تقنية استنساخ حاصلة على براءة اختراع لمساعدة العملاء على استنساخ الجين المستهدف في أي موضع محدد على الناقل المطلوب دون الاعتماد على مواقع تقييد النواقل لتلبية خطط تصميم الاستنساخ المختلفة للعملاء.