الصفحة الرئيسية > أخبار > اخبار الصناعة

بروتوكول تعبير وتنقية البروتين

تحديث الوقت : 2020-10-15

المصدر:

الآراء : 54

بروتوكول تعبير وتنقية البروتين

لا يمكن فصل دراسة وظائف البروتين وإنتاج البروتينات الوظيفية بشكل أساسي عن التعبير غير المتجانسة وتنقية البروتينات.

سأتحدث إليكم اليوم عن تعبير البروتين وتنقيته من الجوانب التالية.


1. اختيار التسمية


علامات التعبير الشائعة حاليًا هي علامته (علامة الهيستيدين) ، علامة GST (علامة الجلوتاثيون سلفهيدريل ترانسفيراز) ، علامة MBP (علامة بروتين ربط المالتوز) ، علامة CBD (علامة منطقة ربط الكيتين)) انتظر.

كل علامة لها خصائص فريدة ، مثل الوزن الجزيئي للعلامة ، وقدرتها على تنظيم قابلية ذوبان البروتين ، وتأثيرها على طي البروتين ، وما إذا كانت بحاجة إلى الاستئصال ، وما إلى ذلك.

اختر ملصقًا مناسبًا وفقًا لخصائص البروتين الذي تريد تنقيته. يتم اختيار الملصق جيدًا ، وستحصل التجارب اللاحقة على ضعف النتيجة بنصف الجهد.

2. بناء ناقلات


بعد تحديد الملصق المراد استخدامه ، من الضروري تحضير ناقل تعبير. في الوقت الحاضر ، هناك العديد من النواقل التجارية للاختيار من بينها ، مثل سلسلة pET28 مع علامة His وسلسلة pMAL مع علامة MBP.

تتضمن معظم سلاسل النواقل شكل إدخال العلامة في الطرف N أو الطرف C ، والتي يمكن اختيارها بمرونة وفقًا لخصائص البروتين.

عند إدخال الجين المشفر للبروتين ، عليك الانتباه لتجنب تغيير الإطارات. إذا كنت تريد إنشاء متجه من نقطة الصفر ، فلا تنسَ إدخال مُحسِّن مناسب وتسلسل إنهاء النسخ. تستخدم متواليات المروج عمومًا المحفزات المحفزة ، وستتسبب المحفزات التأسيسية في التعبير المبكر وتراكم البروتينات الأجنبية ، وهو ما لا يفضي إلى تكاثر المضيف.


3. اختيار المضيف


العوائل الشائعة هي E. coli وخلايا الثدييات والخميرة والحشرات. بالنسبة للإشريكية القولونية ، فإن السلالة الأكثر ملاءمة للتعبير غير المتجانسة هي BL21 وسلالاتها المشتقة ، ولكنها لا تزال بحاجة إلى الاختيار وفقًا لعناصر النسخ والترجمة المحددة في المتجه.


جين البروتياز الداخلي في BL21 مفقود ، لذلك فهو سلالة مناسبة للتعبير عن البروتين الأجنبي ، لكنه لا يحتوي على بوليميريز T7 RNA ، لذلك لا يمكن استخدامه لتعبير البروتين الذي يحتوي على محفز T7 BL21 (DE3) ، في BL21 بناءً على تكامل جينوم الملتهمة T7 ، فهي مناسبة لأنظمة التعبير T7 ، مثل سلسلة pET ؛ BL21 (DE3) PLyS ، استنادًا إلى BL21 (DE3) ، مع جين الليزوزيم T7 ، والذي يمكنه التحكم بشكل أكثر صرامة في التعبير عن بوليميريز T7.


وتجدر الإشارة إلى أنه نظرًا لوجود جينات مثل نوكلياز (endA1) recombinase (recA1) ، فإن البلازميد ليس مستقرًا في سلسلة BL21 من السلالات ، ويمكن دمجه في الجينوم ، وفقدان ، وطفرة ، وما إلى ذلك ، لذلك قم ببناء ناقل جيد لا يزال بحاجة إلى تخزينه في سلالات مثل DH5α.


4. تحسين ظروف الثقافة


بأخذ نظام التعبير عن الإشريكية القولونية كمثال ، يمكن استخدام وسط LB لكل من الإنعاش وزراعة البذور.

من الأفضل استخدام وسيط يحتوي على نسبة عالية من الأحماض الأمينية ولكن مصدر سكر أقل أثناء مرحلة التخمير ، مثل وسط السل لتعزيز تخليق البروتين وتراكمه.

إذا تم استخدام محفز محرض ، فيجب إضافة محفز مثل IPTG عندما تنمو البكتيريا إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتأخرة.

بعد إضافة المحفز ، يجب خفض درجة حرارة المزرعة إلى 16-30 درجة مئوية. كلما انخفضت درجة حرارة المزرعة ، كلما كان تراكم البروتين أبطأ وقل احتمال إنتاج أجسام متضمنة.


5. اختيار مادة عمود التنقية

يحتوي كل ملصق على مادة عمود تنقية مقابلة. تستخدم علامة GST جل الجلوتاثيون ، وتستخدم علامة MBP راتينج السكاريد ، وتستخدم علامة CBD راتينج الكيتين ، وتستخدم العلامة حشوات مقترنة بأيونات معدنية ثنائية التكافؤ ، وأكثرها شيوعًا مقترنة بالنيكل أيوني ، المعروف باسم عمود النيكل.

تم إطلاق تعبئة عمود النيكل NEBExpress (S1428S) حديثًا في نوفمبر 2019. هناك أيضًا نموذج عمود الدوران المعبأ مسبقًا (S1427S / L) ، وهو أكثر ملاءمة لتنقية البروتين الصغير في مرحلة الفرز. يستغرق تنقية البروتين المسمى 1 ملغ 15 دقيقة فقط.

يمكن لكل 1 مل من تعبئة عمود النيكل تنقية 10 مجم من البروتين الموسوم بالهيستيدين ؛

ارتباط محدد للغاية للبروتينات بعلامته ، نقاء> 95٪ بعد الفصل والتنقية ؛

يجعل ارتباط أيون النيكل القوي منه شديد المقاومة لـ EDTA وعوامل الاختزال ، وهو متوافق مع الكواشف الشائعة لتحلل الخلايا القائمة على المنظفات