الصفحة الرئيسية > أخبار > أخبار الشركة

عدة أشكال من التعبير البروتيني في الإشريكية القولونية

تحديث الوقت : 2020-10-19

المصدر:

الآراء : 49

عدة أشكال من التعبير البروتيني في الإشريكية القولونية

يُعد دراسة بنية ووظيفة الجين الأجنبي في نظام التعبير عن البروتين في المختبر جزءًا مهمًا من أبحاث البيولوجيا الجزيئية. يتضمن تعبير البروتين في المختبر التعبير الاندماجي والتعبير غير الاندماجي ، بالإضافة إلى التعبير في أنظمة التعبير عن الثدييات وأنظمة التعبير عن الخميرة وأنظمة التعبير عن خلايا الحشرات. تتميز الإشريكية القولونية بخصائص الفهم الشامل للصفات الوراثية ، والنمو السريع ، والثقافة الاقتصادية ، ومستوى التعبير العالي.

لذلك ، كان تعبير E. coli هو نظام التعبير المفضل للتعبير عن البروتينات الأجنبية لفترة طويلة.



يعد نظام تعبير Escherichia coli هو البكتيريا الهندسية المفضلة لتعبير البروتين ، وهو أيضًا أكثر أنظمة التعبير بدائية النواة استخدامًا على نطاق واسع.

أنشأ باحثو النظم الحيوية العامة منصة خدمة تعبير وتنقية بروتين الإشريكية القولونية الناضجة ، والتي توفر خدمات التعبير والتنقية بما في ذلك البروتينات المؤتلفة المختلفة ومركباتها في الإشريكية القولونية.

تنقسم الإشريكية القولونية إلى ثلاثة تجاويف بواسطة الأغشية الخارجية والداخلية. يقع البروتين المستهدف الذي تم التعبير عنه بواسطة الإشريكية القولونية في التجاويف الثلاثة: داخل الخلايا وخارج الخلية وفي محيط البلازما.
وفقًا لموقع منتج التعبير ، ينقسم تعبير الجين المستهدف في الإشريكية القولونية عمومًا إلى تعبير داخل الخلايا وتعبير إفرازي.
من بينها ، يعد التعبير داخل الخلايا هو أهم أشكال التعبير ، ويمكن تقسيم منتجات التعبير إلى تعبير قابل للذوبان وأشكال جسم متضمنة غير قابلة للذوبان. وفقًا لطبيعة البروتين المستهدف ، ينقسم شكل التعبير عن البروتين المستهدف في E. coli إلى تعبير اندماجي وتعبير غير اندماجي.

1. التعبير داخل الخلايا


غالبًا ما يتم تحديد البروتين المستهدف الذي تعبر عنه الإشريكية القولونية في الخلية. من أجل تجنب التراكم المفرط لمنتج التعبير في الخلية والتأثير على نمو الخلية أو تكوين أجسام متضمنة ، يمكن للبروتين المستهدف القابل للذوبان استخدام التسلسل الوظيفي الخاص به ونظام المعالجة والنقل لبروتين الإشريكية القولونية ، وأخيراً اجتياز غشاء الخلية و تفرز في الفراغ المحيط بين غشاء الخلية وجدار الخلية أو سائل زراعة الخلية.

2. التعبير السري


يعبر البروتين المؤتلف الهدف الغشاء الداخلي للإشريكية القولونية للوصول إلى الفضاء المحيط بالبلازما ، أو يعبر الغشاء الخارجي للوصول إلى الفضاء خارج الخلية ، والذي يسمى بالإفراز. تم العثور على سلسلة من تراكيب تسلسل البروتين Sec المتعلقة بإفراز بروتينات الإشريكية القولونية في الفضاء المحيط بالبروتين ونقل الغشاء خارج الخلية ، بما في ذلك SecA و SecB و SecD و SecE و SecF و SecG و SecY [9 ، هذه 7] . بالإضافة إلى البروتين Sec ، تشارك أيضًا المرافق الجزيئية مثل GroES / GroEL و DnaK / DnaJ و h / Ffs في النقل.

3. تعبير قابل للذوبان


عادة ما يكون التعبير عن الجين المستهدف في الإشريكية القولونية قادرًا على الحصول على تعبير قابل للذوبان مع النشاط البيولوجي. ومع ذلك ، غالبًا ما تتحلل البروتينات الأجنبية بسهولة بواسطة البروتياز المضيف أو تشكل أجسامًا متضمنة مع الحصول على مستويات عالية من التعبير.

لذلك ، من الضروري استكشاف التعبير القابل للذوبان للبروتينات الأجنبية في الإشريكية القولونية. لتحسين التعبير القابل للذوبان عن البروتين المؤتلف ، من الضروري أولاً تحديد ناقل مناسب وبكتيريا مضيفة ، وثانيًا ، يمكن أيضًا تقليل معدل تخليق البروتين المؤتلف.


تظهر الدراسات التي أجريت على نماذج حركية البروتين أن إنتاجية البروتين النشط تعتمد على معدل تخليق البروتين ، ومعدل طي البروتين ، ومعدل تراكم البروتين.

عند المستويات العالية من التعبير ، بمجرد أن يتجاوز معدل تجميع سلسلة الببتيد الوليدة معدل طي البروتين ، سيؤدي ذلك إلى تكوين أجسام متضمنة.

لذلك ، فإن تقليل معدل تخليق البروتين المؤتلف مفيد لزيادة التعبير القابل للذوبان عن البروتين المؤتلف.

تشمل الطرق الشائعة الاستخدام خفض درجة حرارة المزرعة ، واختيار محفز مناسب ، واستخدام تركيز أقل من المحفز.



تركيبة الوسط لها تأثير كبير على تحسين التعبير الذائب للبروتينات المؤتلفة في الإشريكية القولونية.

المرافقة الجزيئية هي نوع من البروتين الذي يمكن أن يساعد سلسلة البولي ببتيد لتشكيل الهيكل الصحيح ثلاثي الأبعاد.

إنه يساعد بشكل أساسي في طي سلسلة الببتيد عن طريق منع أو تصحيح الارتباط غير المعقول الكارهة للماء. لقد وجدت الدراسات أن التعبير المشترك مع المرافقات الجزيئية يمكن أن يحسن قابلية ذوبان البروتين المستهدف ، وإذا تم التعبير عن العديد من المرافقات الجزيئية في نفس الوقت ، فمن الممكن الحصول على نتائج أفضل من استخدامها بمفردها.

من الجدير بالذكر أن اختيار المرافق الجزيئية ذات التعبير المشترك يجب أن يعتمد على خصائص البروتين المؤتلف نفسه.

يعتبر التركيب الأساسي للبروتين ، أي تسلسل الأحماض الأمينية ، عاملاً مهمًا يؤثر على تكوين أجسام الشمول. يمكن أن يؤدي استبدال واحد أو أكثر من الأحماض الأمينية في البروتين إلى منع تكوين أجسام متضمنة وزيادة قابلية الذوبان للمنتج المعبر عنه.

السبب المحتمل هو أن كره الماء من تغيرات البروتين المؤتلف أو استقرار البروتين المؤتلف يزداد بعد الطفرة.


4. شكل تضمين نص التعبير


ومع ذلك ، عندما يتم التعبير عن البروتين المستهدف بكميات كبيرة ، فإن منتج التعبير سوف يتراكم في الإشريكية القولونية ، وسيتم تكوين جزيئات صلبة غير نشطة ، تسمى أجسام التضمين.

يحتوي البروتين المستهدف لجسم التضمين على تسلسل صحيح للأحماض الأمينية ، ولكن نظرًا لأنه لم يتم طيه بشكل صحيح ولديه خطأ في التكوين المكاني ، فهو عمومًا غير نشط بيولوجيًا.

بالمقارنة مع منتجات البروتين المستهدفة القابلة للذوبان ، تتمتع الأجسام المتضمنة بمزايا تخصيب البروتين المستهدف ، ومقاومة البروتياز ، وتقليل السمية للمضيف.

السبب الرئيسي لتكوين أجسام متضمنة هو عدم وجود بعض العوامل المساعدة لطي البروتين أثناء التعبير عن البروتين المستهدف المؤتلف ، أو أن البيئة غير مناسبة لتشكيل روابط ثانوية صحيحة.

العوامل الرئيسية التي تؤثر على تكوين الأجسام المتضمنة هي طبيعة البروتين نفسه ، وظروف المزرعة ، وبروتينات المرافقة الجزيئية.


5. تعبير بروتين الانصهار


تعبير بروتين الانصهار هو توصيل مناطق الترميز لجينين أو أكثر من طرف إلى طرف ، ثم يتم التحكم فيها من خلال نفس التسلسل التنظيمي ، بحيث يكون تعبير اندماج البروتين المستهدف ذو كفاءة عالية ، وأقل تدهور ، وتنقية بسيطة ومريحة.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام موقع انقسام الكاشف الكيميائي أو موقع انقسام البروتياز الذي تم إنشاؤه في ناقل تعبير الاندماج لإزالة الببتيد بدائية النواة لبروتين الاندماج في المختبر للحصول على منتج بروتين طبيعي.

نظرًا لأن بروتين الاندماج سهل التحضير ، فإن لديه احتمالية أكبر للحفاظ على نشاط ومناعة البروتين الأصلي ، ويمكن أيضًا تسويقه لتوفير إمكانية الانقسام اللاحق لبروتين الاندماج للحصول على بروتين حقيقيات النواة بالداخل.

علاوة على ذلك ، لا يمكن أن يؤدي التعبير الاندماجي إلى زيادة كمية تعبير البروتين فحسب ، بل يساعد أيضًا البروتين المستهدف على الانثناء بشكل صحيح للحصول على البروتين القابل للذوبان.


حاليًا ، تشتمل أنظمة التعبير الاندماجية المستخدمة على نطاق واسع على نظام PA ونظام PG ونظام الانصهار الخاص به ونظام GST ونظام FLAG ونظام MBP ونظام الانصهار TrxA وما إلى ذلك.

منتج التعبير المعبر عنه في تعبير بدائية النواة ذو كفاءة عالية ومستقر نسبيًا ولا يتحلل بسهولة من قبل المضيف.


6. تعبير البروتين غير الانصهار


التعبير غير الاندماجي لبروتين معبر عنه غير مدمج مع أي بروتين أو بولي ببتيد للخلية المضيفة هو إدخال الجين المستهدف في المروج القوي لمتجه التعبير وتسلسل SD ، مع كود البدء AUG من الجين الهدف كنقطة انطلاق للترجمة.

لا تحتوي النهاية N لسلسلة الببتيد البروتيني المستهدفة المعبر عنها على البروتين المعبر عنه بواسطة ناقل التعبير بدائية النواة ، ويتوافق البروتين المستهدف المعبر عنه مع البروتين الطبيعي في التسلسل والبنية والمناعة.

تتحلل البروتينات غير الاندماجية بسهولة أو تتلف بواسطة البروتياز في الخلايا المضيفة لإنتاج بروتينات غير نشطة ، مما يؤثر على كفاءة التعبير.


يتميز التعبير عن البروتينات الأجنبية في الإشريكية القولونية بمزايا مستوى التعبير العالي والتشغيل السهل والتكلفة المنخفضة.

تتضمن أشكال التعبير الشائعة التعبير داخل الخلايا ، والتعبير المفرز ، والتعبير القابل للذوبان ، وشكل جسم التضمين غير القابل للذوبان ، والتعبير الاندماجي والتعبير غير الاندماجي.

عدة أشكال. التعبير عن البروتينات الأجنبية في الإشريكية القولونية هو مشروع منهجي. لذلك ، يجب أن نراكم الخبرة في عملية البحث لمعرفة مفتاح تحسين كفاءة تعبير البروتين المؤتلف.

لذلك ، من الممكن استخدام نظام التعبير E. coli للتعبير عن كميات كبيرة من البروتينات الأجنبية النشطة.


يمكن لشركة General Biosystems ، وهي شركة لخدمات التعبير عن البروتين وتنقيته ، أن تزود العملاء بخدمات مضيفة أكثر شيوعًا ، بما في ذلك خلايا الإشريكية القولونية والخميرة والثدييات. إذا كنت تريد استخدام خلايا مضيفة أخرى أو أنظمة تعبير خالية من الخلايا ، فيرجى الاتصال بنا.