استراتيجيات التعبير عن بروتين E. coli عالي الكفاءة

(1) اختيار ناقل التعبير.

اختيار مروج ناقلات التعبير مهم جدا. يؤثر هيكل المروج على تقاربه مع بوليميريز الحمض النووي الريبي ، وبالتالي يؤثر على مستوى التعبير الجيني. يجب أن يرضي المروج المثالي:

(2) تحسين كودون.

عندما يتم التعبير عن الجينات التي تحتوي على عدد كبير من الكودونات النادرة في الإشريكية القولونية ، فإن نقص بعض الحمض النووي الريبي في الإشريكية القولونية سيقلل من كفاءة واستقرار ترجمة الرنا المرسال ، وحتى يتسبب في حدوث أخطاء في الترجمة أو الإنهاء المبكر. يمكن أن يؤدي تعديل كودون للجين المستهدف إلى تحسين استقرار وفعالية ترجمة الرنا المرسال.

(3) بروتينات الانصهار والمرافقات الجزيئية.

لا يمكن استخدام بروتينات الانصهار فقط كعلامات تقارب لتسهيل عمليات التنقية النهائية ، ولكن أيضًا يمكن لبروتينات الاندماج الجزيئي زيادة التعبير القابل للذوبان عن البروتينات ، مثل الجلوتاثيون S ترانسفيراز (GST) ، وبروتين سومو ، وبروتين ربط المالتوز (MBP) ، والتي محبة للماء بدرجة عالية ، تساعد على تحسين قابلية ذوبان البروتين المستهدف واستقراره ؛ يمكن أن يعزز التعبير المشترك للمرافقين الجزيئي الطي بعد الترجمة ومعالجة البروتينات المؤتلفة ، وتحسين قابلية ذوبان البروتين واستقراره.

يشيع استخدام نظام E. coli في أنظمة GroEL و GroES ؛ نظام بروتين الصدمة الحرارية DnaK و DnaJ و GrpE ؛ عائلة Dsb (اختزال رابطة ثنائي كبريتيد وإيزوميراز) ، والتي يمكن أن تعزز تكوين روابط ثاني كبريتيد.

(4) توطين والتعبير عن البروتين المستهدف.

بعد تصنيع البروتين المؤتلف في الإشريكية القولونية ، هناك 4 مواضع ، تحديدًا في السيتوبلازم ، والفضاء المحيط بالبروتين ، والغشاء الداخلي أو الخارجي ، والمصفوفة خارج الخلية.

استخدم ببتيدات الإشارة لإفراز البروتينات المؤتلفة في المحيط المحيط أو الوسط خارج الخلية. تساعد البيئة المؤكسدة في الفضاء المحيط بالبلازما على تكوين روابط ثاني كبريتيد والطي الصحيح للبروتينات القائمة على thio ؛ يكون البروتياز في الفضاء المحيطي أقل منه في الخلية العديدة ، لتقليل تدهور البروتين المستهدف ؛ كما أن عدد البروتينات في الفضاء المحيط بالبلازما أقل بكثير من ذلك الموجود في الخلية ، مما يؤدي إلى تنقية البروتين المستهدف.

(5) اختيار سلالات التعبير.

قد يتسبب عدد كبير جدًا من البروتياز الداخلي في السلالة في عدم استقرار منتجات التعبير الخارجية. لذلك ، غالبًا ما تصبح بعض السلالات التي تعاني من نقص البروتياز سلالات تعبير أولية مثالية.

تكمل سلسلة Rosetta2 tRNAs (AUA و AGG و AGA و CUA و CCC و GGA و CGG) المقابلة لسبعة أكواد نادرة تفتقر إلى E. coli ، وتحسن مستوى التعبير عن الجينات الأجنبية ، وخاصة الجينات حقيقية النواة ، في نظام بدائيات النواة ؛ سلالات K -12 المشتقة من سلسلة Origami 2 وسلالات trxB و gor المزدوجة المتحولة ، تزيد بشكل كبير من احتمال تكوين رابطة ثاني كبريتيد في السيتوبلازم وتعزز التعبير عن البروتين القابل للذوبان. تجمع Rosetta-gami ™ بين مزايا نوعي السلالات المذكورين أعلاه.

فهو لا يكمل 7 أنواع من الكودونات النادرة فحسب ، بل يعزز أيضًا تكوين روابط ثاني كبريتيد ويساعد في التعبير عن البروتينات حقيقية النواة التي تتطلب مساعدة روابط ثاني كبريتيد لتشكيل شكل مطوي صحيح.

(6) شروط الاستقراء وظروف الثقافة

تعتبر ظروف الاستقراء وظروف الاستزراع مهمة أيضًا للتعبير عن البروتينات المؤتلفة ، مثل درجة الحرارة. عندما تكون درجة الحرارة أعلى ، يكون تعبير البروتين مرتفعًا ولكن من السهل تكوين أجسام متضمنة ، بينما عندما تكون درجة الحرارة منخفضة ، يكون تعبير البروتين منخفضًا ، ولكن يمكن أن يزيد من قابلية ذوبان البروتين المستهدف ؛ يؤثر تركيز المحفز أيضًا على كفاءة التعبير عن البروتين المؤتلف ، مثل تركيز IPTG منخفض التركيز يمكن أن يزيد من محتوى البروتين القابل للذوبان.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤثر تركيبة المغذيات ودرجة الحموضة وغيرها من المعلمات للوسط على مستوى النشاط والإفراز والتعبير للبروتياز.