ثلاثة أنظمة تعبير عن البروتين المؤتلف

اختيار ناقل التعبير:

إن اختيار ناقل التعبير عن بروتين الاندماج مقيد بالعديد من العوامل. بادئ ذي بدء ، يجب أن يكون هناك موقع استنساخ متعدد مناسب على المتجه. ثانيًا ، من الضروري تحديد علامة الاندماج المناسبة وفقًا لشروط تنقية البروتين اللاحقة.

علامات الاندماج شائعة الاستخدام هي His.Tag و GST.Tag و Nus.Tag و Trx.Tag. من بينها ، تعد علامته صغيرة نسبيًا وليس لها تأثير واضح على الخصائص الهيكلية للبروتين.

بعد تنقية كروماتوغرافيا التقارب ، لا يلزم إزالة العلامة ؛ ومع ذلك ، يجب إزالة علامة أكبر قليلاً مثل GST مع إنزيم معين في العملية اللاحقة. في العديد من التطبيقات العملية ، غالبًا ما يكون من المرغوب فيه التعبير عن بروتين نشط قابل للذوبان.

تعتمد قابلية ذوبان البروتين المستهدف المحدد على العديد من العوامل ، بما في ذلك الناقل. يمكن للناقل مع GST.Tag زيادة قابلية ذوبان بروتين الاندماج.

اختيار سلالة المضيف:

قد تختلف حالة التعبير عن نفس البروتين في مضيفين مختلفين. تعد مضيفات سلسلة BL21 هي الأكثر استخدامًا حاليًا. يمكن لسلالة مضيف Rosetta المشتقة من BL21 تعزيز التعبير عن البروتينات حقيقية النواة بكودونات نادرة من الإشريكية القولونية.

تكمل هذه السلالة tRNAs من الكودونات AUA و AGG و AGA و CUA و CCC و GGA من خلال بلازميد مقاوم للكلورامفينيكول. وبهذه الطريقة ، توفر سلالة Rosetta ترجمة "عالمية" ، وبالتالي تجنب قيود التعبير بسبب تكرار استخدام كودون الإشريكية القولونية. يسهل مضيف BL21 (DE3) تشكيل هيئات التضمين.

شروط الاستقراء:

تؤثر التغييرات في ظروف الاستقراء أيضًا على تعبير البروتين. بشكل عام ، هناك حاجة إلى البروتينات القابلة للذوبان في الغالب في التطبيقات العملية ، الأمر الذي يتطلب إيجاد درجة حرارة الاستقراء الأكثر ملاءمة.

ستكون نسبة البروتين القابل للذوبان الذي يتم تصنيعه بواسطة معظم البروتينات تحت درجة حرارة منخفضة (15 25 ℃) بين عشية وضحاها في ظروف الحث كبيرة نسبيًا.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن تركيز المحفز له أيضًا تأثير على حالة التعبير عن البروتين ، والتركيز المنخفض للمحفز مفيد للتعبير عن البروتين القابل للذوبان. قد تؤدي درجة الحرارة المرتفعة إلى زيادة سرعة تخليق البروتين ، وسرعة طي المواد الوسيطة لتشكيل الركام ، وقوة التفاعل الكارهة للماء.

من المحتمل أن يوجد البروتين المعبر عنه في شكل أجسام متضمنة. يمكن أن يؤدي التركيز الأعلى للمحفز (0.8-10mM IPTG) أيضًا إلى تعزيز تكوين أجسام متضمنة في البكتيريا. بالنسبة لمؤتلات pET مع محفزات T7 العادية ، يمكن تحفيز IPTG بتركيز نهائي قدره 0.5 ملي مولار تمامًا ، بينما تتطلب ناقلات مع محفزات T7lac IPTG بتركيز نهائي قدره 0.8 ملي مولار ليتم تحفيزها بالكامل.