الصفحة الرئيسية > أخبار > اخبار الصناعة

ما هي طرق زيادة التعبير عن البروتين القابل للذوبان؟

تحديث الوقت : 2021-01-05

المصدر:

الآراء : 64

ما هي طرق زيادة التعبير عن البروتين القابل للذوبان؟
بسبب ظروف الاستزراع البسيطة للبكتيريا بدائية النواة والإدخال المريح للجينات الأجنبية ، فقد أصبح نظامًا مهمًا للتعبير عن البروتين المؤتلف. بعد أن يتحول الجين إلى سلالة ، فإن حثه على التعبير عن البروتين المستهدف في سلالة المضيف ، وجمعه وتنقيته هو طريقة تقليدية لتعبير البروتين.

ومع ذلك ، فإن البروتينات التي يتم التعبير عنها بدائية النواة والتي يمكن أن تظهر نشاطًا بيولوجيًا هي عادةً بروتينات قابلة للذوبان موجودة في المادة الطافية ، ولا يكون للأجسام المتضمنة غير القابلة للذوبان أي نشاط بيولوجي.

لذلك ، أصبح التعبير القابل للذوبان عن البروتين المستهدف هو السعي وراء معظم تجارب التعبير عن البروتين. إن كيفية تقليل أو تجنب ظهور أجسام الدمج هي أيضًا مشكلة ابتليت بها معظم الناس.

expression of soluble protein

إذن ، ما هي طرق زيادة التعبير عن البروتين القابل للذوبان؟


  • تقليل معدل تخليق البروتين

تخليق البروتين ليس بالسرعة الممكنة. في كثير من الحالات ، يتم تصنيع البروتينات في بكتيريا بدائية النواة بسرعة كبيرة ، مما يؤدي إلى عدم كفاية الوقت للثني وتشكيل أجسام مدمجة. في ضوء ذلك ، يمكننا أن نبدأ من الجوانب التالية.


1. خفض درجة حرارة الثقافة.

2. استخدام المروجين الأضعف.

3. تقليل تركيز المحرض.

4. استخدام البلازميدات منخفضة النسخ كناقلات للجينات الأجنبية.
من أجل زيادة التعبير البروتيني ، يقوم العديد من الأشخاص عادةً بتعديل الظروف المختلفة إلى الأفضل أثناء التعبير عن البروتين ، مثل الحفاظ على درجة حرارة المزرعة المثلى ، واستخدام محفزات قوية ، وزيادة تركيز المحرضات ، واستخدام بلازميدات عالية النسخ.

يمكن أن تزيد هذه الأساليب بالفعل من تعبير البروتين المستهدف ، ولكنها ستجعل أيضًا معدل تعبير البروتين سريعًا جدًا ، وغير قادر على الطي بالكامل وتشكيل أجسام متضمنة. لذلك ، إذا كان هناك عدد كبير جدًا من الهيئات المدرجة ، فقد يكون التعديل المناسب لهذه العوامل المؤثرة حلاً.

بمجرد فشل التجربة ، يستغرق الأمر الكثير من الوقت والطاقة لاستكشاف الظروف من البداية. يوصى بتجربة مجموعة متنوعة من الظروف في بداية التجربة ، باستخدام بلازميدات مختلفة ، ومحفزات قوة مختلفة ، وظروف استزراع مختلفة ، وتركيزات محفزات مختلفة. استكشف أفضل الظروف للتعبير القابل للذوبان في البروتين لتحسين معدل تحمل الخطأ للتجربة.

  • تغيير التركيبة المتوسطة

وسط الاستزراع هو المصدر المباشر للمواد اللازمة لنمو البكتيريا. يمكن أن يساعد تعديل تكوين وسط الاستزراع في تنظيم معدل تخليق البروتين البكتيري وتحسين استقرار بنية البروتين. التدابير تشمل:


1. إضافة درجة الحموضة العازلة لضبط درجة الحموضة أثناء الثقافة ؛

2. أضف مجموعات اصطناعية أو عوامل أنزيم تساعد البروتينات على الانطواء بشكل صحيح وتحسين استقرار البروتين ؛

3. إضافة محلول جلوكوز 1٪ لتقليل التعبير الناجم عن IPTG (إيزوبروبيل ثيوجالاكتوزيد) ؛

4. أضف السكروز والبوليول (أو السوربيتول) لزيادة الضغط الأسموزي للمحلول المتوسط. ستؤدي الزيادة في الضغط الاسموزي إلى تراكم عوامل الحماية التناضحية داخل الخلايا ، والتي يمكن أن تحسن استقرار البروتين المستهدف.

5. أضف الإيثانول ، مركابتان منخفض الوزن الجزيئي ، مركبات ثنائي كبريتيد وكلوريد الصوديوم.

  • التعبير المشترك مع مرافق جزيئي أو إنزيم قابل للطي


يلعب البروتينان ، المرافقات الجزيئية والإنزيمات القابلة للطي ، دورًا مهمًا للغاية في عملية التعبير عن البروتين في الكائنات الحية. يمكن أن يؤدي التعبير المشترك عنهم مع البروتين المستهدف إلى تعزيز الطي الصحيح للبروتين وزيادة التعبير عن البروتين القابل للذوبان عند التعبير عن البروتين.

المرافقات الجزيئية: يمكن للمرافقين الجزيئيين مساعدة سلائف البروتين على الانطواء بشكل صحيح. تشمل المرافق الجزيئية شائعة الاستخدام في نظام تعبير الإشريكية القولونية ما يلي:

GroES-GroEL، DnaK-DnaJ-GrpE، ClpB.

إنزيم الطي: عن طريق تقليل حاجز الطاقة أثناء الطي ، فإنه يساعد البروتين المستهدف على تكوين شكل نشط. تلعب الأنواع الثلاثة التالية من الإنزيمات القابلة للطي دورًا مهمًا في التعبير عن البروتين.

1. PPI's (peptidyl prolyl cis / trans isomerases) ؛

2. DsbA (ثنائي كبريتيد أوكسيريدوكتاز رابطة أوكسيريدوكتاز) و DsbC (ثنائي كبريتيد إيزوميراز ثنائي كبريتيد أيزوميراز) ؛

3. PDI (بروتين إيزوميراز ثاني كبريتيد).

يعتمد مستوى التعبير المشترك للبروتين المستهدف والمرافق الجزيئي أو إنزيم الطي على طبيعة البروتين المحدد. أظهرت الدراسات أنه عندما يتم دمج DsbA و DsbC مع البروتين ، فيمكنهما أيضًا زيادة مستوى التعبير الذائب للبروتين.

  • التعبير المشترك مع علامة الانصهار


تعد إضافة علامات إلى N-terminal و C-terminal لتحسين التعبير القابل للذوبان عملية روتينية في معظم التجارب. العلامات المستخدمة بشكل شائع هي: MBP (بروتين ربط المالتوز) ، GST (الجلوتاثيون سلفهيدريل ترانسفيراز) ، SUMO (بروتين معدل صغير يشبه يوبيكويتين) ، NusA ، TrxA (ثيوردوكسين) و DsbA و DsbC المذكورة أعلاه.

علامة GST (الجلوتاثيون سلفهيدريل ترانسفيراز) هي العلامة الأكثر استخدامًا للذوبان. له تأثير ذوبان معين ، لكنه يستخدم بشكل أساسي لتنقية التقارب. ولعلامة GST أيضًا تأثير مفيد آخر على البروتينات المؤتلفة ، وهو تقليل التدهور في الخلايا المضيفة وزيادة استقرار البروتين.

الميزة الأكثر بروزًا لعلامة MBP هي قدرتها القوية على تعزيز الذوبان. أظهرت الدراسات أن ميزة علامة MBP هي أنها تلعب دورًا قويًا في تعزيز التعبير الذائب لبروتينات الغشاء. تمت إضافة علامة MBP إلى 42 بروتينًا غشائيًا تم التعبير عنها بشكل ناقص أو لم يتم التعبير عنها في E. coli ، 29 منها كانت قابلة للذوبان ، خاصةً تم التعبير بنجاح عن جميع البروتينات الجزيئية الصغيرة التي تتراوح من 10 إلى 20 كيلو دالتون.

أكبر ميزة لعلامات SUMO هي أنه يمكن تحديدها على وجه التحديد بواسطة بروتياز SUMO وتدهورها بكفاءة ، مما يجعل عملية إزالة العلامات اللاحقة دقيقة وفعالة. تم استخدام علامة سومو بنجاح للتعبير عن الاندماج في البكتيريا. لا يمكن أن يعزز فقط من قابلية ذوبان البروتين المؤتلف ، ولكن أيضًا يزيد من تعبيره.

تمتلك NusA نشاطًا بيولوجيًا يتمثل في تعزيز نسخ الحمض النووي وإبطاء الترجمة ، مما يمنح البروتين المعبر عنه مزيدًا من الوقت لينطوي. يتيح التعبير المستقر والنشط للبروتينات المؤتلفة. حتى إذا لم تتم إزالة علامة NusA ، يمكن أن يظل بروتين الاندماج نشطًا. لذلك ، عند مقارنتها بعلامات إزالة الذوبان الأخرى ، تتمتع NusA أيضًا بمزايا فريدة.

إذا واجهت عددًا كبيرًا جدًا من هيئات التضمين في التجربة ، فإن المادة الطافية لا تعبر عن المشكلة ،

يمكنك أيضًا تجربة الطرق المذكورة أعلاه. إذا كنت لا تزال غير قادر على حلها ، فيمكنك أيضًا التفكير في Generalbiosystems لمساعدتك. نحن شركة متخصصة في تحضير البروتين المؤتلف.